عملکرد چهار روش تکثیر اسید نوکلئیک برای شناسایی SARS-CoV-2 در اتیوپی

از بازدید شما از Nature.com متشکریم. شما از نسخه مرورگری با پشتیبانی محدود از CSS استفاده می‌کنید. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر به‌روز استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
یک چرخ و فلک از سه اسلاید را به طور همزمان نمایش می‌دهد. از دکمه‌های قبلی و بعدی برای حرکت بین سه اسلاید به طور همزمان استفاده کنید، یا از دکمه‌های کشویی در انتها برای حرکت بین سه اسلاید به طور همزمان استفاده کنید.
از زمان شیوع بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19)، بسیاری از آزمایش‌های تجاری تکثیر اسید نوکلئیک (NAAT) در سراسر جهان توسعه یافته و به سنجش‌های استاندارد تبدیل شده‌اند. اگرچه چندین آزمایش به سرعت توسعه یافته و در آزمایش‌های تشخیصی آزمایشگاهی به کار گرفته شدند، اما عملکرد این آزمایش‌ها در محیط‌های مختلف ارزیابی نشده است. بنابراین، این مطالعه با هدف ارزیابی عملکرد سنجش‌های Abbott SARS-CoV-2، Daan Gene، BGI و Sansure Biotech با استفاده از استاندارد مرجع ترکیبی (CRS) انجام شد. این مطالعه از 1 تا 30 دسامبر 2020 در موسسه بهداشت عمومی اتیوپی (EPHI) انجام شد. 164 نمونه نازوفارنکس با استفاده از کیت کوچک QIAamp RNA و سیستم آماده‌سازی نمونه Abbott DNA استخراج شد. از 164 نمونه، 59.1٪ مثبت و 40.9٪ برای CRS منفی بودند. مثبت بودن Sansure Biotech در مقایسه با CRS به طور قابل توجهی پایین بود (p < 0.05). مثبت بودن Sansure Biotech در مقایسه با CRS به طور قابل توجهی پایین بود (p < 0.05). Положительные результаты Sansure Biotech были значительно ниже по сравнению со CRS (p <0,05). نتایج مثبت Sansure Biotech در مقایسه با CRS به طور قابل توجهی کمتر بود (p < 0.05).与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p <0.05）.与CRS 相比，Sansure Biotech 的阳性率显着较低（p <0.05）. در Sansure Biotech было значительно کمتر به کمک CRS (p < 0,05). Sansure Biotech در مقایسه با CRS نتایج مثبت به طور قابل توجهی کمتری داشت (p < 0.05).توافق کلی چهار آنالیز در مقایسه با CRS، ۹۶.۳ تا ۱۰۰ درصد بود. علاوه بر نرخ مثبت پایین سنجش Sansure Biotech، عملکرد چهار سنجش تقریباً قابل مقایسه بود. به همین ترتیب، سنجش Sansure Biotech [فقط برای تحقیقات (RUO)] برای استفاده در اتیوپی نیاز به اعتبارسنجی بیشتری دارد. در نهایت، تحقیقات بیشتری باید برای ارزیابی سنجش‌ها با ادعاهای مناسب سازنده در نظر گرفته شود.
آزمایش آزمایشگاهی بخشی از برنامه استراتژیک سازمان بهداشت جهانی (WHO) برای آمادگی و واکنش به بیماری کرونا 2019 (کووید-19) (SPRP) است. سازمان بهداشت جهانی توصیه می‌کند که کشورها برای بهبود آمادگی، مدیریت صحیح موارد ابتلا، هوشیاری و واکنش سریع به چالش‌های بهداشت عمومی، باید ظرفیت آزمایشگاهی خود را افزایش دهند. این نشان می‌دهد که نقش آزمایشگاه در توصیف بیماری و اپیدمیولوژی عوامل عفونی نوظهور و کنترل شیوع آنها کلیدی است.
تشخیص کووید-۱۹ نیازمند اطلاعات اپیدمیولوژیک و پزشکی، علائم/نشانه‌های شخصی و داده‌های رادیوگرافی و آزمایشگاهی است. از زمان گزارش شیوع کووید-۱۹ در ووهان چین، بسیاری از آزمایش‌های تجاری تکثیر اسید نوکلئیک (NAAT) در سراسر جهان توسعه یافته‌اند. واکنش زنجیره‌ای پلیمراز رونویسی معکوس در زمان واقعی (rRT-PCR) به عنوان یک روش معمول و استاندارد برای تشخیص آزمایشگاهی عفونت سندرم حاد تنفسی شدید ۲ (SARS-CoV-2) استفاده شده است. تشخیص مولکولی SARS-CoV-2 معمولاً بر اساس ژن‌های N (ژن پروتئین نوکلئوکپسید)، E (ژن پروتئین پوششی) و RdRp (ژن RNA پلیمراز وابسته به RNA) در ناحیه ORF1a/b (ژن قاب خواندن باز ۱a/b) شناسایی شده از ژنوم ویروسی است. آنها به عنوان مناطق اصلی حفاظت شده موجود در ژنوم‌های ویروسی برای تشخیص ویروس در نظر گرفته می‌شوند. در میان این ژن‌ها، ژن‌های RdRp و E حساسیت تشخیص تحلیلی بالایی دارند، در حالی که ژن N حساسیت تحلیلی پایینی دارد.
عملکرد روش‌های PCR ممکن است بسته به عوامل مختلفی مانند: معرف‌های استخراج، معرف‌های تکثیر/تشخیص، روش استخراج، کیفیت دستگاه PCR و سایر ابزارها متفاوت باشد. تا آوریل 2020، بیش از 48 دستگاه تشخیصی مختلف از نه کشور مجوز استفاده اضطراری (EUA) را برای تشخیص کووید-196 دریافت کرده‌اند. در اتیوپی، بیش از 14 پلتفرم PCR در لحظه برای تشخیص PCR SARS-CoV-2 در 26 موسسه بهداشت عمومی، از جمله ABI 7500، Abbott m2000، Roche 48000 و Quant-studio7 استفاده می‌شود. علاوه بر این، کیت‌های آزمایش PCR مختلفی مانند آزمایش Daan Gene، آزمایش Abbott SARS-CoV-2، آزمایش Sansure Biotech و آزمایش SARS-CoV-2 BGI در دسترس هستند. اگرچه rRT-PCR بسیار حساس است، برخی از بیماران مبتلا به COVID-19 به دلیل کپی‌های ناکافی از اسید ریبونوکلئیک ویروسی (RNA) در نمونه‌ها به دلیل شرایط و اقدامات نامناسب پرسنل، نتایج منفی کاذب گزارش می‌کنند.8 علاوه بر این، سوء استفاده از نمونه یا کنترل، تنظیم آستانه چرخه (Ct) و واکنش متقاطع با سایر اسیدهای نوکلئیک بیماری‌زا یا RNA غیرفعال/باقیمانده SARS-CoV-2 می‌تواند منجر به نتایج مثبت کاذب در سنجش‌های rRT-PCR9 شود. بنابراین، واضح است که آزمایش‌های PCR در واقع می‌توانند ناقلین قطعات ژنی را شناسایی کنند، زیرا آنها حتی نمی‌توانند بین ژن‌های ویروسی واقعاً فعال تمایز قائل شوند، بنابراین این آزمایش‌ها فقط می‌توانند ناقلین را شناسایی کنند و نه بیماران را.10 بنابراین، ارزیابی عملکرد تشخیصی با استفاده از روش‌های استاندارد در شرایط ما مهم است. اگرچه بسیاری از معرف‌های NAAT در موسسه بهداشت عمومی اتیوپی (EPHI) و در سراسر کشور موجود است، اما هنوز هیچ ارزیابی مقایسه‌ای از اثربخشی آنها گزارش نشده است. بنابراین، این مطالعه با هدف ارزیابی عملکرد مقایسه‌ای کیت‌های موجود در بازار برای تشخیص SARS-CoV-2 با استفاده از rRT-PCR با استفاده از نمونه‌های بالینی انجام شد.
در مجموع ۱۶۴ شرکت‌کننده مشکوک به کووید-۱۹ در این مطالعه گنجانده شدند. اکثر نمونه‌ها از مراکز درمانی (۷۲٪ = ۱۱۸/۱۶۴) بودند، در حالی که ۴۶ شرکت‌کننده باقی‌مانده (۲۸٪) از مراکز غیردرمانی بودند. در میان شرکت‌کنندگانی که در مرکز درمان نشدند، ۱۵ نفر (۹.۱٪) موارد مشکوک بالینی و ۳۱ نفر (۱۸.۹٪) با موارد تایید شده در تماس بودند. ۹۳ نفر (۵۶.۷٪) از شرکت‌کنندگان مرد بودند و میانگین (± انحراف معیار) سنی شرکت‌کنندگان ۳۱.۱۰ (± ۱۱.۸۲) سال بود.
در این مطالعه، میزان مثبت و منفی چهار آزمایش برای کووید-۱۹ تعیین شد. بنابراین، میزان مثبت سنجش Abbott SARS-CoV-2، سنجش Daan Gene 2019-nCoV، سنجش SARS-CoV-2 BGI و سنجش Sansure Biotech 2019-nCoV به ترتیب ۵۹.۱٪، ۵۸.۵٪، ۵۷.۹٪ و ۵۵.۵٪ بود. نمرات استاندارد مرجع ترکیبی مثبت و منفی (CRS) به ترتیب ۹۷ (۵۹.۱٪) و ۶۷ (۴۰.۹٪) بود (جدول ۱). در این مطالعه، تعریف CRS بر اساس قانون "هرگونه مثبت" بود، که به موجب آن از چهار نتیجه آزمایش، دو یا چند نتیجه آزمایش که نتیجه یکسانی داشتند، مثبت یا منفی واقعی در نظر گرفته شدند.
در این مطالعه، ما برای همه تجزیه و تحلیل‌ها در مقایسه با CRS، درصد توافق منفی (NPA) 100٪ (95٪ CI 94.6-100) را مشاهده کردیم. تجزیه و تحلیل Sansure Biotechnology حداقل PPA 93.8٪ (95٪ CI 87.2-97.1) را نشان داد و تجزیه و تحلیل Daan Gene 2019-nCoV توافق کلی 99.4٪ (95٪ CI 96.6-99.9) داشت. در مقابل، توافق کلی بین سنجش BGI SARS-CoV-2 و سنجش Sansure Biotech 2019-nCoV به ترتیب 98.8٪ و 96.3٪ بود (جدول 2).
ضریب توافق کاپای کوهن بین نتایج سنجش CRS و Abbott SARS-CoV-2 کاملاً سازگار بود (K = 1.00). به طور مشابه، مقادیر کاپای کوهن که توسط Daan Gene 2019-nCoV، SARS-CoV-2 BGI و Sansure Biotech 2019-nCoV شناسایی شده بودند نیز کاملاً با CRS سازگار بودند (K ≥ 0.925). در این تجزیه و تحلیل مقایسه‌ای، آزمون کای دو (آزمون مک نمار) نشان داد که نتایج سنجش Sansure Biotech 2019-nCoV تفاوت معنی‌داری با نتایج CRS داشت (p = 0.031) (جدول 2).
همانطور که در شکل نشان داده شده است.۱. درصد کمترین مقدار Ct (<20 Ct) در روش Abbott SARS-CoV-2 (ترکیب ژن RdRp و N) ۸۷.۶٪ بود و مقدار Ct ژن ORF1a/b در روش Sansure Biotech 2019-nCoV نشان داد که درصد مقدار Ct پایین (<20 Ct) 50.3٪ و مقدار Ct بالا (۳۶-۴۰ Ct) 3.2٪ بود. ۱. درصد کمترین مقدار Ct (<20 Ct) در روش Abbott SARS-CoV-2 (ترکیب ژن RdRp و N) ۸۷.۶٪ بود و مقدار Ct ژن ORF1a/b در روش Sansure Biotech 2019-nCoV نشان داد که درصد مقدار Ct پایین (<20 Ct) 50.3٪ و مقدار Ct بالا (۳۶-۴۰ Ct) 3.2٪ بود.همانطور که در شکل نشان داده شده است.1، процент наименьшего значения Ct (< 20 Ct) تجزیه و تحلیل Abbott SARS-CoV-2 (تلفیق ژن RdRp و N) 87.6٪، یک معنی Ct در ORF1a/b تحلیل Sansure Biotech 2019-nCoV به دلیل что процент низкого значения Ct (< 20 Ct) شامل 50.3% است، و مقدار Ct (36-40 Ct) تشکیل شده است 3.2%. همانطور که در شکل ۱ نشان داده شده است، درصد کمترین مقدار Ct (<20 Ct) در آنالیز Abbott SARS-CoV-2 (ژن ترکیبی RdRp و N) 87.6٪ بود و مقدار Ct آنالیز ژن ORF1a/b در Sansure Biotech 2019-nCoV نشان داد که درصد مقدار Ct پایین (<20 Ct) 50.3٪ و Ct با مقدار بالا (36-40 Ct) 3.2٪ بود.如图1 所示， Abbott SARS-CoV-2 检测（结合RdRp 和N 基因）的最低Ct 值百分比（7<20 Bitech 2019-nCoV 检测的ORF1a/b 基因Ct 值显示低Ct 值(< 20 Ct) 的百分比为50.3%，高Ct 值Ct (3)的百分比为3.2%. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، کمترین درصد مقدار Ct (<20 Ct) در آزمایش Abbott SARS-CoV-2 (ترکیبی از ژن RdRp و N) 87.6٪ است، مقدار Ct ژن ORF1a/b در آزمایش Sansure Biotech 2019-nCoV نشان می‌دهد که درصد Ct (<20 Ct) پایین 50.3٪ و درصد Ct (36-40 Ct) پایین 3.2٪ است. چگونه می‌توان در risunke 1، آنالیز Abbott SARS-CoV-2 (همراه با ژن‌های RdRp و N) نام‌گذاری فقط کمی از اهمیت Ct (< 20 Ct) در حدود 87.6٪، یک معنی Ct گنا ORF1a/b در исследовании Sansure Biotech 2019- Analiz nCoV منتشر شد پایین Ct. همانطور که در شکل 1 نشان داده شده است، روش Abbott SARS-CoV-2 (ترکیب ژن‌های RdRp و N) کمترین درصد مقدار Ct (<20 Ct) را با 87.6٪ داشت، در حالی که مقدار Ct ژن ORF1a/b در مطالعه Sansure Biotech 2019 - تجزیه و تحلیل nCoV، Ct پایینی را نشان داد. درصد معنی (< 20 Ct) 50.3% را شامل می شود. درصد مقادیر (<20 Ct) 50.3٪ و درصد مقادیر بالای Ct (36-40 Ct) 3.2٪ بود.آزمایش ابوت SARS-CoV-2 B مقادیر Ct بالای 30 را ثبت کرد. از سوی دیگر، در سنجش BGI برای SARS-CoV-2، ژن ORF1a/b مقدار Ct بالایی (بیش از 36 Ct) داشت و درصد آن 4٪ بود (شکل 1). از سوی دیگر، در سنجش BGI برای SARS-CoV-2، ژن ORF1a/b مقدار Ct بالایی (بیش از 36 Ct) داشت و درصد آن 4٪ بود (شکل 1). در تجزیه و تحلیل BGI SARS-CoV-2 ژن ORF1a/b با مقدار Ct (> 36 Ct)، درصد ضریب تشکیل 4% (ریس. 1). از سوی دیگر، در تجزیه و تحلیل BGI ژن SARS-CoV-2، ORF1a/b مقدار Ct بالایی (> 36 Ct) داشت که درصد آن 4٪ بود (شکل 1).另一方面，在BGI SARS-CoV-2 检测中，ORF1a/b 基因具有高Ct 值（> 36 Ct）的百分比中 از سوی دیگر، در تشخیص BGI SARS-CoV-2، درصد ژن ORF1a/b با مقدار Ct بالا (>36 Ct) 4٪ است (شکل 1). در تجزیه و تحلیل BGI SARS-CoV-2، ORF1a/b با مشخصه های Ct (>36 Ct) 4% (ریس. 1) را تجزیه و تحلیل کرد. از سوی دیگر، در تجزیه و تحلیل BGI SARS-CoV-2، درصد ژن‌های ORF1a/b با مقادیر Ct بالا (>36 Ct) 4٪ بود (شکل 1).
در این مطالعه، ۱۶۴ نمونه از نازوفارنکس گرفته شد. برای همه انواع سنجش‌ها، جداسازی و تکثیر RNA با استفاده از روش‌ها و کیت‌های توصیه‌شده توسط تولیدکنندگان مربوطه انجام شد.
این مطالعه نشان داد که آزمایش ابوت برای SARS-CoV-2 عملکرد تشخیصی مشابه CRS دارد، با 100٪ تطابق مثبت، منفی و کلی. توافق کاپا کوهن 1.00 است که نشان دهنده توافق کامل با CRS است. یک مطالعه مشابه توسط دانشگاه واشنگتن در ایالات متحده نشان داد که حساسیت و ویژگی کلی آزمایش ابوت برای SARS-CoV-2 به ترتیب 93٪ و 100٪ بود، در مقایسه با سنجش آزمایشگاهی (LDA) CDC. 11. سیستم تشخیص ابوت SARS-CoV-2 مبتنی بر تشخیص همزمان ترکیبی ژن‌های N و RdRp است، زیرا هر دو ژن حساس‌تر هستند و منفی‌های کاذب را به حداقل می‌رسانند12. یک مطالعه در وین، اتریش نیز نشان داد که حجم زیاد نمونه استخراج و حجم زیاد شوینده تشخیص، اثرات رقیق‌سازی را به حداقل رسانده و راندمان تشخیص را افزایش می‌دهد13. بنابراین، تطابق کامل Abbott برای سنجش SARS-CoV-2 می‌تواند با یک سیستم تشخیص پلتفرم مرتبط باشد که همزمان ژن‌های ترکیبی را تشخیص می‌دهد، تعداد زیادی نمونه (0.5 میلی‌لیتر) استخراج می‌کند و از مقدار زیادی شوینده (40 میکرولیتر) استفاده می‌کند.
نتایج ما همچنین نشان داد که عملکرد تشخیص آزمایش ژنتیکی Daan تقریباً مشابه CRS است. این با مطالعه‌ای14 که در دانشگاه Anhui در Huainan چین انجام شد و ادعای سازنده مبنی بر توافق 100٪ مثبت مطابقت دارد. علیرغم گزارش‌هایی از نتایج ثابت، یک نمونه پس از آزمایش مجدد همان محلول، منفی کاذب بود، اما در سنجش‌های Abbott SARS-CoV-2 و Sansure Biotech nCoV-2019 مثبت بود. این نشان می‌دهد که ممکن است در نتایج انواع مختلف سنجش‌ها، تنوع وجود داشته باشد. با این وجود، در مطالعه‌ای که در چین انجام شد15، نتیجه سنجش ژن Daan در مقایسه با سنجش مرجع تعریف‌شده در آزمایشگاه، تفاوت معنی‌داری (p < 0.05) داشت. با این وجود، در مطالعه‌ای که در چین انجام شد15، نتیجه سنجش ژن Daan در مقایسه با سنجش مرجع تعریف‌شده در آزمایشگاه، تفاوت معنی‌داری (p < 0.05) داشت. این موضوع نیست، در исследовании, проведенном во Китае15، نتیجه تجزیه و تحلیل Daan Gene значительно отличался (p < 0,05) از их лабораторного эталонного آنالیزا با این حال، در مطالعه‌ای در چین15، نتیجه تجزیه و تحلیل Daan Gene به طور قابل توجهی (p < 0.05) با تجزیه و تحلیل مرجع آزمایشگاهی آنها متفاوت بود.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差异（p < 0.05）.然而，在中国进行的研究中15，大安基因检测的结果与其实验室定义的参考检测相比有显着差<0.05 Однако в исследовании, проведенном во Китае15, نتیجه آزمایش ژنتیکی Daan معنی دارن отличались (p < 0,05) по сравнению с его эталонным лабораторным тестом. با این حال، در مطالعه‌ای در چین15، نتایج آزمایش ژنتیکی دان در مقایسه با آزمایش آزمایشگاهی مرجع آن، تفاوت معنی‌داری (0.05>p) داشت.این اختلاف ممکن است به دلیل حساسیت آزمایش مرجع برای تشخیص SARS-CoV-2 باشد و مطالعات بیشتر برای تعیین علت آن ممکن است مهم باشد.
علاوه بر این، مطالعه ما عملکرد مقایسه‌ای سنجش BGI برای SARS-CoV-2 را با CRS ارزیابی کرد و درصد توافق مثبت عالی (PPA = 97.9٪)، درصد توافق منفی (NPA = 100٪) و درصد توافق کلی بر اساس جنسیت (OPA) را نشان داد. = 98.8٪. مقادیر کاپای کوهن توافق خوبی را نشان داد (K = 0.975). مطالعات در هلند16 و چین15 نتایج ثابتی را نشان داده‌اند. آزمایش BGI برای SARS-CoV-2 یک آزمایش تشخیص تک ژنی (ORF1a/b) با استفاده از محلول تکثیر/تشخیص 10 میکرولیتر است. با وجود توافق آماری خوب با نتایج مرجع ما، تجزیه و تحلیل دو نمونه مثبت (1.22٪) از کل نمونه را از دست داد. این می‌تواند پیامدهای بالینی بزرگی برای پویایی انتقال در سطح بیمار و جامعه داشته باشد.
یکی دیگر از تجزیه و تحلیل‌های مقایسه‌ای که در این مطالعه گنجانده شد، سنجش Sansure Biotech nCoV-2019 rRT-PCR (RUO) بود؛ درصد تطابق کلی 96.3٪ بود. قدرت توافق نیز با مقدار کاپای کوهن تعیین شد که 0.925 بود و نشان‌دهنده توافق کامل با CRS است. باز هم، نتایج ما با مطالعات انجام شده در دانشگاه مرکزی جنوبی در چانگشا، چین و در بخش آزمایشگاه بالینی بیمارستان مردمی لیوژو، شهر لیوژو، چین17 یکسان است. اگرچه تطابق آماری خوبی در بالا ثبت شد، آزمون کای دو (آزمون مک نمار) نشان داد که نتیجه سنجش Sansure Biotech در مقایسه با CRS تفاوت آماری معنی‌داری داشته است (0.005 > p). اگرچه تطابق آماری خوبی در بالا ثبت شد، آزمون کای دو (آزمون مک نمار) نشان داد که نتیجه سنجش Sansure Biotech در مقایسه با CRS تفاوت آماری معنی‌داری داشته است (0.005 > p). Несмотря на то, что было зафиксировано указанное выше хорошее статистическое соответствие, критерий хи-квадрат (критерий Манемара) показал, что результат анализа Sansure Biotech имеет статистически значимое различие по сравнению со CRS (p < 0,005). اگرچه توافق آماری خوبی در بالا ثبت شد، آزمون کای دو (آزمون مک نمار) نشان داد که نتیجه سنجش Sansure Biotech در مقایسه با CRS تفاوت آماری معنی‌داری دارد (0.005 > p).尽管记录了上述良好的统计一致性，但卡方检验（MacNemar 检验）表明，Sansure Biotech相比具有统计学显着差异（p <0.005）.尽管 记录 了 上述 良好 统计 一致性 ， 但 检验 （（ماکنمار结果 与 crs 相比 具有 显着 （（p <0.005.......... . значимую تنوع (p < 0,005) بین تجزیه و تحلیل Sansure Biotech و CRS. علیرغم توافق آماری خوبی که در بالا ذکر شد، آزمون کای دو (آزمون مک نمار) تفاوت آماری معنی‌داری (p < 0.005) بین سنجش Sansure Biotech و CRS نشان داد.شش نمونه (3.66٪) در مقایسه با CRS منفی کاذب بودند (جدول تکمیلی 1)؛ این موضوع بسیار مهم است، به خصوص با توجه به پویایی انتقال ویروس. داده‌های فوق نیز از این نرخ پایین تشخیص پشتیبانی می‌کنند15.
در این مطالعه، مقادیر Ct برای هر سنجش و پلتفرم مربوطه تعیین شد، که کمترین میانگین مقدار Ct در سنجش Abbott SARS-CoV-2 گزارش شده است. این نتیجه ممکن است مربوط به سیستم آزمایش ژنتیکی ترکیبی همزمان Abbott برای تشخیص SARS-CoV-2 باشد. بنابراین، طبق شکل 1، 87.6٪ از نتایج Abbott SARS-CoV-2 مقادیر Ct زیر 20 داشتند. تنها تعداد کمی از نتایج نمونه (12.4٪) در محدوده 20-30 بودند. مقادیر Ct بالای 30 ثبت نشد. علاوه بر استفاده Abbott از فرمت آزمایش ژنتیکی پنل SARS-CoV-2، این نتیجه ممکن است مربوط به حد تشخیص پایین‌تر (32.5 کپی RNA در میلی‌لیتر)18 باشد که سه برابر کمتر از حد پایین شرکت یعنی 100 کپی RNA در میلی‌لیتر)19 است.
این مطالعه محدودیت‌هایی دارد: اولاً، ما به دلیل کمبود منابع، روش‌های استاندارد/مرجع [مانند بار ویروسی یا سایر آزمایش‌های آزمایشگاهی (LDA)] نداریم. ثانیاً، تمام نمونه‌های مورد استفاده در این مطالعه از سواب‌های نازوفارنکس بودند، در حالی که نتایج برای سایر انواع نمونه‌ها قابل استفاده نبود و ثالثاً، حجم نمونه ما کوچک بود.
این مطالعه عملکرد چهار روش rRT-PCR برای SARS-CoV-2 را با استفاده از نمونه‌های نازوفارنکس مقایسه کرد. همه روش‌های تشخیص، به استثنای روش Sansure Biotech، عملکرد تقریباً مشابهی داشتند. علاوه بر این، میزان مثبت بودن پایین در سنجش Sansure Biotech در مقایسه با CRS مشاهده شد (p < 0.05). علاوه بر این، میزان مثبت بودن پایین در سنجش Sansure Biotech در مقایسه با CRS مشاهده شد (p < 0.05). Кроме того, в тесте Sansure Biotech был выявлен низкий процент положительных результатов по сравнению со CRS (p < 0,05). علاوه بر این، آزمایش Sansure Biotech درصد پایینی از نتایج مثبت را در مقایسه با CRS نشان داد (p < 0.05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0.05).此外，与CRS 相比，Sansure Biotech 检测的阳性率较低(p <0.05). Кроме того، تجزیه و تحلیل Sansure Biotech namel بیشتر از حد پایین است که به کمک CRS (p < 0,05). علاوه بر این، روش Sansure Biotech در مقایسه با CRS میزان مثبت بودن کمتری داشت (p < 0.05).تجزیه و تحلیل Sansure Biotech nCoV-2019 (RUO) از PPA، NPA و توافق کلی از 93.5٪ با قدرت توافق کوهن کاپا 0.925 فراتر رفت. در نهایت، سنجش Sansure Biotech (RUO) برای استفاده در اتیوپی نیاز به اعتبارسنجی بیشتر دارد و تحقیقات بیشتری باید برای ارزیابی ادعاهای تولیدکنندگان انفرادی در نظر گرفته شود.
طراحی مطالعه تطبیقی ​​در چهار مرکز درمانی در آدیس آبابا، بیمارستان اکا کوتبه، مرکز درمانی کلیسای هزاره، بیمارستان یادبود زوودیتو و بیمارستان تخصصی سل سنت پیتر انجام شد. داده‌ها بین ۱ تا ۳۱ دسامبر ۲۰۲۰ جمع‌آوری شد. مراکز درمانی برای این مطالعه به صورت هدفمند و بر اساس تعداد بالای موارد ابتلا و در دسترس بودن مراکز درمانی اصلی در شهر انتخاب شدند. به طور مشابه، ابزارها، از جمله ابزارهای PCR بلادرنگ ABI 7500 و Abbott m2000، طبق توصیه‌های تولیدکنندگان معرف NAAT انتخاب شدند و چهار کیت تشخیص PCR برای این مطالعه انتخاب شد، زیرا اکثر آزمایشگاه‌ها در اتیوپی حداقل از چهار مورد از آنها استفاده می‌کردند. آزمایش ژن، آزمایش Abbott SARS-CoV-2، آزمایش Sansure Biotech و آزمایش SARS-CoV-2 BGI در طول مطالعه انجام شد.
آزمایش SARS-CoV-2 از ۱ تا ۳۰ دسامبر ۲۰۲۰ با استفاده از ۳ میلی‌لیتر محیط انتقال ویروسی (VTM) (Miraclean Technology، شنژن، چین) از افراد تحت بررسی برای کووید-۱۹ که به EPHI ارجاع داده شده بودند، انجام شد. نمونه‌های نازوفارنکس توسط جمع‌آوری‌کنندگان نمونه آموزش‌دیده جمع‌آوری و در بسته‌های سه‌تایی به EPHI ارسال شد. قبل از جداسازی اسید نوکلئیک، به هر نمونه یک شماره شناسایی منحصر به فرد اختصاص داده می‌شود. استخراج از هر نمونه بلافاصله پس از ورود با استفاده از روش‌های استخراج دستی و خودکار انجام می‌شود. بنابراین، برای استخراج خودکار Abbott m2000، ۱.۳ میلی‌لیتر (شامل ۰.۸ میلی‌لیتر حجم مرده و ۰.۵ میلی‌لیتر حجم ورودی استخراج) از هر نمونه استخراج و از سیستم آماده‌سازی نمونه DNA Abbott (Abbott Molecular Inc. des Plaines, IL, USA) عبور داده شد. ) یک دسته ۹۶ تایی [۹۲ نمونه، دو کنترل تشخیصی و دو کنترل غیرالگو (NTC)] در فرآیند کلی (بازیابی و تشخیص) دو دور استخراج SARS-CoV-2 (EUA) در زمان واقعی گنجانده شد. به طور مشابه، برای استخراج دستی، از همان نمونه‌ها (برای استخراج و کشف خودکار) استفاده کنید. بنابراین، در طول فرآیند، ۱۴۰ نمونه میکرولیتری با استفاده از کیت RNA ویروسی QIAamp (QIAGEN GmbH، هیلدن، آلمان) در دسته‌های ۲۴ تایی (شامل ۲۰ نمونه، دو کنترل سنجش و دو NTC) طی نه دور استخراج شدند. عصاره‌های استخراج شده دستی با استفاده از یک چرخه حرارتی ABI 7500 با استفاده از سنجش BGI SARS-CoV-2، سنجش Daan Gene و سنجش Sansure Biotech تکثیر و شناسایی شدند.
جداسازی و خالص‌سازی خودکار RNA ویروسی SARS-CoV-2 از اصل مهره مغناطیسی با استفاده از معرف‌های آماده‌سازی نمونه DNA Abbott پیروی می‌کند. غیرفعال‌سازی نمونه‌ها و حل کردن ذرات ویروسی با استفاده از یک شوینده حاوی گوانیدین ایزوتیوسیانات برای دناتوره کردن پروتئین و غیرفعال کردن RNase انجام می‌شود. سپس RNA با جداسازی فاز جامد با استفاده از سیلیس از پروتئین جدا می‌شود، یعنی نمک گوانیدینیوم و pH قلیایی بافر لیز، اتصال اسیدهای نوکلئیک به سیلیس (SiO2) را تقویت می‌کند. مرحله شستشو، پروتئین‌ها و بقایای باقی مانده را حذف می‌کند تا یک محلول شفاف تولید شود. RNA شفاف با استفاده از میدان مغناطیسی دستگاه از میکروذرات مبتنی بر سیلیس جدا می‌شود20،21. از سوی دیگر، جداسازی و خالص‌سازی دستی RNA با روش ستون چرخشی با استفاده از سانتریفیوژ به جای پایه مغناطیسی و جداسازی میکروذرات از محلول انجام می‌شود.
آزمایش تشخیص SARS-CoV-2 در زمان واقعی Abbott (Abbott Molecular, Inc.) طبق دستورالعمل سازنده که EUA19,22 را از WHO و FDA دریافت کرده بود، انجام شد. در این پروتکل، غیرفعال‌سازی نمونه قبل از استخراج در حمام آب با دمای 56 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه انجام شد. پس از غیرفعال‌سازی ویروس، استخراج اسید نوکلئیک با استفاده از دستگاه Abbott m2000 SP از 0.5 میلی‌لیتر VTM با استفاده از سیستم آماده‌سازی نمونه DNA Abbott m2000 طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. تکثیر و تشخیص با استفاده از دستگاه Abbott m2000 RT-PCR انجام شد و تشخیص دوگانه برای ژن‌های RdRp و N (ROX) و VIC P (رنگ اختصاصی) برای هدف‌گیری و تشخیص کنترل‌های داخلی انجام شد که امکان تشخیص همزمان هر دو محصول تکثیر را فراهم می‌کرد. 19
روش تشخیص تکثیر این کیت مبتنی بر فناوری RT-PCR یک مرحله‌ای است. ژن‌های ORF1a/b و N به عنوان نواحی حفاظت‌شده توسط فناوری ژن Daan برای تشخیص تکثیر ناحیه هدف انتخاب شدند. پرایمرهای اختصاصی و پروب‌های فلورسنت (پروب‌های ژن N نشاندار شده با FAM، پروب‌های ORF1a/b نشاندار شده با VIC) برای تشخیص RNA SARS-CoV-2 در نمونه‌ها طراحی شده‌اند. شوینده نهایی و مخلوط‌های اصلی با اضافه کردن 5 میکرولیتر شوینده به 20 میکرولیتر از مخلوط اصلی تا حجم نهایی 25 میکرولیتر تهیه شدند. تکثیر و تشخیص به طور همزمان بر روی دستگاه PCR در زمان واقعی ABI 750024 انجام شد.
ژن‌های ORF1a/b و N با استفاده از کیت تشخیصی اسید نوکلئیک Sansure Biotech nCoV-2019 (تشخیص PCR فلورسنت) شناسایی شدند. با انتخاب کانال FAM برای ناحیه ORF1a/b و کانال ROX برای ژن N، پروب‌های اختصاصی برای هر ژن هدف تهیه کنید. به این کیت سنجش، شوینده و واکنشگرهای مخلوط اصلی به شرح زیر اضافه می‌شوند: 30 میکرولیتر واکنشگر مخلوط اصلی و 20 میکرولیتر نمونه شسته شده را برای تشخیص/تکثیر آماده کنید. برای تکثیر/تشخیص از PCR در زمان واقعی ABI 750025 استفاده شد.
آزمایش SARS-CoV-2 BGI یک کیت rRT-PCR فلورسنت در زمان واقعی برای تشخیص کووید-19 است. ناحیه هدف در ناحیه ORF1a/b ژنوم SARS-CoV-2 قرار دارد که یک روش تشخیص تک ژنی است. علاوه بر این، ژن خانه‌دار انسانی β-actin یک ژن هدف تنظیم‌شده داخلی است. مخلوط اصلی با مخلوط کردن 20 میکرولیتر از معرف مخلوط اصلی و 10 میکرولیتر از نمونه RNA استخراج‌شده در یک پلیت چاهک‌دار تهیه می‌شود26. برای تکثیر و تشخیص از دستگاه PCR کمی فلورسنت ABI 7500 در زمان واقعی استفاده شد. تمام تکثیر اسید نوکلئیک، شرایط اجرای PCR برای هر سنجش و تفسیر نتایج طبق دستورالعمل‌های سازنده مربوطه انجام شد (جدول 3).
در این تحلیل مقایسه‌ای، ما از روش استاندارد مرجع برای تعیین درصد توافق (مثبت، منفی و کلی) و سایر پارامترهای مقایسه برای چهار تحلیل استفاده نکردیم. هر مقایسه آزمایش با CRS انجام شد، در این مطالعه CRS با قانون "هرگونه مثبت" تعیین شد و نتیجه تعیین شد، نه با یک آزمایش واحد، ما حداقل از دو نتیجه آزمایش منطبق استفاده کردیم. علاوه بر این، در مورد انتقال کووید-19، نتایج منفی کاذب خطرناک‌تر از نتایج مثبت کاذب هستند. بنابراین، برای اینکه با دقت هرچه بیشتر از یک نتیجه CRS بگوییم "مثبت"، حداقل دو آزمایش سنجش باید مثبت باشند، به این معنی که احتمالاً حداقل یک نتیجه مثبت از یک آزمایش EUA حاصل می‌شود. بنابراین، از چهار نتیجه آزمایش، دو یا چند نتیجه آزمایش که نتیجه یکسانی می‌دهند، مثبت یا منفی واقعی در نظر گرفته می‌شوند18،27.
داده‌ها با استفاده از فرم‌های استخراج داده‌های ساختاریافته جمع‌آوری شدند، ورود داده‌ها و تجزیه و تحلیل آن‌ها با استفاده از نرم‌افزار آماری Excel و SPSS نسخه 23.0 برای آمار توصیفی انجام شد. درصد توافق مثبت، منفی و کلی مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت و از امتیاز کاپا برای تعیین میزان توافق هر روش با CRS استفاده شد. مقادیر کاپا به شرح زیر تفسیر می‌شوند: 0.01 تا 0.20 برای توافق خفیف، 0.21 تا 0.40 برای توافق کلی، 0.41-0.60 برای توافق متوسط، 0.61-0.80 برای توافق عمده و 0.81-0.99 برای توافق کامل28.
مجوز اخلاقی از دانشگاه آدیس آبابا اخذ شد و تمام پروتکل‌های آزمایشی این مطالعه توسط هیئت بررسی اخلاق علمی مؤسسه بهداشت عمومی اتیوپی تأیید شد. شماره مرجع مجوز اخلاق EPHI، EPHI/IRB-279-2020 است. تمام روش‌ها مطابق با توصیه‌ها و مفاد دستورالعمل‌های جامع ملی اتیوپی برای درمان کووید-۱۹ اعمال شدند. علاوه بر این، قبل از شرکت در مطالعه، رضایت‌نامه کتبی آگاهانه از همه شرکت‌کنندگان در مطالعه اخذ شد.
تمام داده‌های به‌دست‌آمده یا تحلیل‌شده در این مطالعه در این مقاله منتشرشده گنجانده شده است. داده‌های پشتیبان نتایج این مطالعه، بنا به درخواست معقول، از نویسنده مربوطه در دسترس هستند.
سازمان بهداشت جهانی. توصیه‌هایی برای استراتژی‌های آزمایش آزمایشگاهی برای کووید-۱۹: راهنمای موقت، ۲۱ مارس ۲۰۲۰، شماره WHO/2019-nCoV/lab_testing/2020.1 (WHO، ۲۰۲۰).
مولیو، دی‌اس، پانتازوپولوس، آی. و گورگولیانیس، کی. تشخیص هوشمند کووید-۱۹ در بخش اورژانس: همه‌جانبه در عمل. مولیو، دی‌اس، پانتازوپولوس، آی. و گورگولیانیس، کی. تشخیص هوشمند کووید-۱۹ در بخش اورژانس: همه‌جانبه در عمل.مولیو، دی‌اس، پانتازوپولوس، آی. و گورگولیانیس، کی. آی. تشخیص هوشمند کووید-۱۹ در بخش اورژانس: همه چیز در عمل.مولیو دی‌اس، پانتازوپولوس آی. و گورگولیانیس کی. آی. تشخیص هوشمند کووید-۱۹ در بخش‌های اورژانس: ادغام سرتاسری در عمل. مجله تخصصی Respire. medicine. 3، 263–272 (2022).
میچل، اس. ال. و سنت جورج، کی. ارزیابی روش کووید-۱۹ ID NOW EUA. میچل، اس. ال. و سنت جورج، کی. ارزیابی روش کووید-۱۹ ID NOW EUA.میچل، اس. ال. و سنت جورج، کی. ارزیابی روش کووید-۱۹ ID NOW EUA.میچل اس. ال. و سنت جورج کی. ارزیابی روش کووید-۱۹ ID NOW EUA. مجله بالینی. ویروس. ۱۲۸، ۱۰۴۴۲۹. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104429 (۲۰۲۰).
سازمان بهداشت جهانی. تشخیص آزمایشگاهی بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) در موارد مشکوک به بیماری انسانی. https://www.who.int/publications/i/item/10665-331501 (دسترسی در 15 آگوست 2020) (سازمان بهداشت جهانی، 2020).
اودوگاما، ب. و همکاران. تشخیص کووید-19: بیماری‌ها و ابزارهای آزمایش. ACS Nano 14(4)، 3822–3835 (2020).
سید س. و همکاران. تأسیس کالج پاتولوژیست‌های شرق، مرکز و جنوب آفریقا - مدرسه منطقه‌ای پاتولوژی خاورمیانه و آفریقای جنوبی. آفریقا. مجله آزمایشگاه پزشکی. 9(1)، 1-8 (2020).
موسسه بهداشت عمومی اتیوپی، وزارت بهداشت فدرال. استراتژی و راهنمای ملی موقت برای تشخیص آزمایشگاهی کووید-۱۹. https://ephi.gov.et/images/novel_coronavirus/EPHI_PHEOC_COVID-19_Laboratory_Diagnosis_Eng.pdf (دسترسی در ۱۲ آگوست ۲۰۲۰) (EPHI، ۲۰۲۰).
ولوشین، س.، پاتل، ن. و کسلهایم، ع. آزمایش‌های منفی کاذب برای چالش‌ها و پیامدهای عفونت SARS-CoV-2. ولوشین، س.، پاتل، ن. و کسلهایم، ع. آزمایش‌های منفی کاذب برای چالش‌ها و پیامدهای عفونت SARS-CoV-2.ولوشین س.، پاتل ن. و کسلهیم آ. اس. آزمایش‌های منفی کاذب برای عفونت‌های SARS-CoV-2 و پیامدهای آنها.ولوشین س.، پاتل ن. و کسلهیم آ. اس. آزمایش‌های منفی کاذب برای تحریک و تأثیر عفونت SARS-CoV-2. مجله پزشکی انگلستان. 383(6)، e38 (2020).
موارد مثبت کاذب و منفی کاذب کووید-۱۹: راهبردهای پیشگیری و مدیریت تنفسی، واکسیناسیون و دیدگاه‌های بیشتر. مولیو، دی‌اس و گورگولیانیس، کی‌آی. موارد مثبت کاذب و منفی کاذب کووید-۱۹: راهبردهای پیشگیری و مدیریت تنفسی، واکسیناسیون و دیدگاه‌های بیشتر. مولیو، دی‌اس و گورگولیانیس، کی‌آی. Mouliou, DS & Gourgoulianis, KI Loжноположительные и ложноотрицательные موارد COVID-19: پرسپکتیو مولیو، دی‌اس و گورگولیانیس، کی‌آی موارد مثبت کاذب و منفی کاذب کووید-۱۹: راهبردهای پیشگیری و درمان تنفسی، واکسیناسیون و راه پیش رو.مولیو، دی‌اس و گورگولیانیس، کی. آی. موارد مثبت کاذب و منفی کاذب کووید-19: راهبردهای پیشگیری و درمان تنفسی، واکسیناسیون و راه پیش رو. Expert Reverend Respire. medicine. 15(8)، 993–1002 (2021).
مولیو، دی‌اس، یوانیس، پی. و کنستانتینوس، جی. تشخیص کووید-۱۹ در بخش اورژانس: دیدن درخت اما از دست دادن جنگل. مولیو، دی‌اس، یوانیس، پی. و کنستانتینوس، جی. تشخیص کووید-۱۹ در بخش اورژانس: دیدن درخت اما از دست دادن جنگل.مولیو، دی‌اس، یوانیس، پی. و کنستانتینوس، جی. تشخیص کووید-۱۹ در بخش اورژانس: درخت را ببین، جنگل را از دست بده.مولیو دی‌اس، یوانیس پی.، و کنستانتینوس جی. تشخیص کووید-۱۹ در اورژانس‌ها: جنگل کافی برای درختان وجود ندارد. ظاهر. پزشکی. مجله. https://doi.org/10.1136/emermed-2021-212219 (2022).
دگلی-آنجلی، ای. و همکاران. اعتبارسنجی و اعتبارسنجی عملکرد تحلیلی و بالینی سنجش ابوت RealTime SARS-CoV-2. مجله ویروس‌شناسی بالینی. 129، 104474. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104474 (2020).
مولایی، ح. ر.، افشار، ع. ا.، کلانتر-نیستانکی، د.، فضلعلی‌پور، م. و افلاطونیان، ب. مقایسه پنج مجموعه آغازگر از نواحی مختلف ژنوم کووید-۱۹ برای تشخیص عفونت ویروس با استفاده از RT-PCR معمولی. مولایی، ح. ر.، افشار، ع. ع.، کلانتر-نیستانکی، د.، فضلعلی‌پور، م. و افلاطونیان، ب. مقایسه پنج مجموعه آغازگر از مناطق مختلف ژنوم کووید-۱۹ برای تشخیص عفونت ویروس با استفاده از RT-PCR معمولی.مولایی، ح. ر.، افشار، ع. ع.، کلانتر-نیستانکی، د.، فضلعلی‌پور، م. و افلاطونیان، ب. مقایسه پنج مجموعه آغازگر از مناطق مختلف ژنوم کووید-19 برای تشخیص عفونت ویروسی با استفاده از RT-PCR معمولی. ملایی، HR، افشار، AA، کلانتر-نیستانکی، D.، فضلعلی پور، M. & Aflatoonian، B. 比较来自COVID-19不同基因组区域的五个引物组，用于通过常规RT-PCR 检测病毒感染。 مولایی، ح. ر.، افشار، ع. ع.، کلانتر-نیستانکی، د.، فضلعلی‌پور، م. و افلاطونیان، ب. مقایسه ۵ ناحیه ژنتیکی مختلف کووید-۱۹ برای تشخیص عفونت ویروسی با استفاده از RT-PCR معمولی.مولایی، حمیدرضا، افشار، علی‌اکبر، کلانتر نیستانکی، د، فضلعلی‌پور، م. و افلاطونیان، ب. مقایسه پنج مجموعه آغازگر از مناطق مختلف ژنوم کووید-۱۹ برای تشخیص عفونت ویروسی با استفاده از RT-PCR معمولی.ایران. مجله میکروبیولوژی. 12(3)، 185 (2020).
گورتزر، آی. و همکاران. نتایج اولیه برنامه ملی ارزیابی کیفیت خارجی برای تشخیص توالی‌های ژنوم SARS-CoV-2. مجله بالینی. ویروس. 129، 104537. https://doi.org/10.1016/j.jcv.2020.104537 (2020).
وانگ، م. و همکاران. ارزیابی تحلیلی اثربخشی پنج کیت RT-PCR برای سندرم حاد تنفسی شدید کروناویروس 2. مجله بالینی. آزمایشگاهی. مقعد. 35(1)، e23643 (2021).
وانگ بی. و همکاران. ارزیابی هفت کیت تشخیص RNA SARS-CoV-2 موجود در بازار چین بر اساس واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) در زمان واقعی. بالینی. شیمیایی. آزمایشگاهی. پزشکی. 58(9)، e149–e153 (2020).
ون کاسترن، پی‌بی و همکاران. مقایسه هفت کیت تشخیصی تجاری RT-PCR کووید-19. مجله بالینی. ویروس. 128، 104412 (2020).
لو، یو و همکاران. مقایسه عملکرد تشخیصی دو کیت PCR برای تشخیص اسیدهای نوکلئیک SARS-CoV-2. مجله بالینی. آزمایشگاهی. مقعد. 34(10)، e23554 (2020).
لفارت، پی آر، و غیره. یک مطالعه مقایسه‌ای از چهار پلتفرم آزمایش تکثیر اسید نوکلئیک SARS-CoV-2 (NAAT) نشان داد که عملکرد ID NOW بسته به نوع بیمار و نمونه به طور قابل توجهی کاهش یافته است. تشخیص. میکروبیولوژی. عفونت. diss. 99(1), 115200 (2021).
مولکول ابوت. بروشور آنالیز لحظه‌ای SARS-CoV-2 ابوت. https://www.molecular.abbott/us/en/products/infectious-disease/RealTime-SARS-CoV-2-Assay. 1-12. (تا 10 آگوست 2020) (2020).
کلاین، اس. و همکاران. جداسازی RNA ویروس SARS-CoV-2 با استفاده از دانه‌های مغناطیسی برای تشخیص سریع در مقیاس بزرگ توسط RT-qPCR و RT-LAMP. Virus 12(8)، 863 (2020).