عوامل تداخلی در واکنش‌های PCR

در طول واکنش PCR، اغلب با برخی عوامل مداخله‌گر مواجه می‌شویم.
با توجه به حساسیت بسیار بالای PCR، آلودگی به عنوان یکی از مهمترین عوامل مؤثر بر نتایج PCR در نظر گرفته می‌شود و می‌تواند نتایج مثبت کاذب ایجاد کند.
منابع مختلفی که منجر به نتایج منفی کاذب می‌شوند نیز به همان اندازه حیاتی هستند. اگر یک یا چند بخش اساسی از مخلوط PCR یا خود واکنش تکثیر مهار یا مختل شوند، سنجش تشخیصی می‌تواند با مشکل مواجه شود. این می‌تواند منجر به کاهش کارایی و حتی نتایج منفی کاذب شود.
علاوه بر مهار، از دست دادن یکپارچگی اسید نوکلئیک هدف ممکن است به دلیل شرایط حمل و نقل و/یا نگهداری قبل از آماده‌سازی نمونه رخ دهد. به طور خاص، دمای بالا یا نگهداری ناکافی ممکن است منجر به آسیب سلول‌ها و اسیدهای نوکلئیک شود. تثبیت سلول و بافت و جاسازی پارافین از علل شناخته شده قطعه قطعه شدن DNA و یک مشکل مداوم هستند (به شکل‌های ۱ و ۲ مراجعه کنید). در این موارد، حتی جداسازی و خالص‌سازی بهینه نیز کمکی نخواهد کرد.

شکل ۱ | تأثیر بی‌حرکتی بر یکپارچگی DNA
الکتروفورز ژل آگارز نشان داد که کیفیت DNA استخراج شده از بخش‌های پارافینی کالبدشکافی‌ها به طور قابل توجهی متفاوت بود. DNA با طول قطعات متوسط ​​​​متفاوت، بسته به روش تثبیت، در عصاره‌ها وجود داشت. DNA فقط زمانی که در نمونه‌های منجمد طبیعی و در فرمالین خنثی بافر شده تثبیت می‌شد، حفظ می‌شد. استفاده از تثبیت‌کننده بوئن به شدت اسیدی یا فرمالین حاوی اسید فرمیک بدون بافر، منجر به از دست رفتن قابل توجه DNA شد. بخش باقی مانده بسیار قطعه قطعه شده است.
در سمت چپ، طول قطعات بر حسب جفت کیلوباز (kbp) بیان شده است.

شکل ۲ | از دست رفتن یکپارچگی اهداف اسید نوکلئیک
(الف) شکاف ۳′-۵′ در هر دو رشته منجر به شکستگی در DNA هدف می‌شود. سنتز DNA همچنان در قطعه کوچک رخ خواهد داد. با این حال، اگر محل اتصال پرایمر روی قطعه DNA وجود نداشته باشد، فقط تکثیر خطی رخ می‌دهد. در مطلوب‌ترین حالت، قطعات ممکن است یکدیگر را دوباره اشباع کنند، اما بازده کم و زیر سطح تشخیص خواهد بود.
(ب) از دست دادن بازها، عمدتاً به دلیل دپوریناسیون و تشکیل دایمر تیمیدین، منجر به کاهش تعداد پیوندهای H و کاهش Tm می‌شود. در طول فاز گرمایش طولانی، پرایمرها از DNA ماتریکس جدا می‌شوند و حتی در شرایط ملایم‌تر نیز به هم متصل نمی‌شوند.
(ج) بازهای تیمین مجاور، یک دایمر TT تشکیل می‌دهند.
یکی دیگر از مشکلات رایج که اغلب در تشخیص مولکولی رخ می‌دهد، آزادسازی کمتر از حد مطلوب اسیدهای نوکلئیک هدف در مقایسه با استخراج فنل-کلروفرم است. در موارد شدید، این می‌تواند با نتایج منفی کاذب همراه باشد. با لیز جوشاندن یا هضم آنزیمی بقایای سلولی می‌توان زمان زیادی را صرفه‌جویی کرد، اما این روش اغلب به دلیل آزادسازی ناکافی اسید نوکلئیک منجر به حساسیت پایین PCR می‌شود.

مهار فعالیت پلیمراز در طول تکثیر

به طور کلی، مهار به عنوان یک مفهوم ظرف برای توصیف تمام عواملی که منجر به نتایج PCR کمتر از حد مطلوب می‌شوند، استفاده می‌شود. در یک مفهوم کاملاً بیوشیمیایی، مهار به فعالیت آنزیم محدود می‌شود، یعنی از طریق برهمکنش با جایگاه فعال DNA پلیمراز یا کوفاکتور آن (مثلاً Mg2+ برای Taq DNA پلیمراز) تبدیل سوبسترا به محصول را کاهش می‌دهد یا از آن جلوگیری می‌کند.
اجزای موجود در نمونه یا بافرها و عصاره‌های مختلف حاوی معرف‌ها می‌توانند مستقیماً آنزیم را مهار کنند یا کوفاکتورهای آن (مثلاً EDTA) را به دام بیندازند، در نتیجه پلیمراز را غیرفعال کرده و به نوبه خود منجر به کاهش یا منفی کاذب شدن نتایج PCR شوند.
با این حال، بسیاری از فعل و انفعالات بین اجزای واکنش و اسیدهای نوکلئیک حاوی هدف نیز به عنوان "مهارکننده‌های PCR" تعیین می‌شوند. هنگامی که یکپارچگی سلول با جداسازی مختل می‌شود و اسید نوکلئیک آزاد می‌شود، فعل و انفعالات بین نمونه و محلول اطراف آن و فاز جامد می‌تواند رخ دهد. به عنوان مثال، "جاروبنده‌ها" می‌توانند از طریق فعل و انفعالات غیر کووالانسی به DNA تک یا دو رشته‌ای متصل شوند و با کاهش تعداد اهدافی که در نهایت به ظرف واکنش PCR می‌رسند، در جداسازی و خالص‌سازی اختلال ایجاد کنند.
به طور کلی، مهارکننده‌های PCR در اکثر مایعات بدن و معرف‌های مورد استفاده برای آزمایش‌های تشخیصی بالینی (اوره در ادرار، هموگلوبین و هپارین در خون)، مکمل‌های غذایی (ترکیبات آلی، گلیکوژن، چربی، یون‌های Ca2+) و اجزای موجود در محیط (فنل‌ها، فلزات سنگین) وجود دارند.

مهارکننده‌های PCR شایع‌تر را می‌توان در باکتری‌ها و سلول‌های یوکاریوتی، DNA غیرهدف، ماکرومولکول‌های متصل‌شونده به DNA در ماتریکس بافت و تجهیزات آزمایشگاهی مانند دستکش و پلاستیک یافت. خالص‌سازی اسیدهای نوکلئیک در طول یا پس از استخراج، روش ترجیحی برای حذف مهارکننده‌های PCR است.
امروزه، تجهیزات مختلف استخراج خودکار می‌توانند جایگزین بسیاری از پروتکل‌های دستی شوند، اما بازیابی و/یا خالص‌سازی ۱۰۰٪ اهداف هرگز حاصل نشده است. مهارکننده‌های بالقوه ممکن است هنوز در اسیدهای نوکلئیک خالص‌شده وجود داشته باشند یا ممکن است قبلاً اثر خود را گذاشته باشند. استراتژی‌های مختلفی برای کاهش تأثیر مهارکننده‌ها وجود دارد. انتخاب پلیمراز مناسب می‌تواند تأثیر قابل توجهی بر فعالیت مهارکننده داشته باشد. سایر روش‌های اثبات‌شده برای کاهش مهار PCR، افزایش غلظت پلیمراز یا استفاده از افزودنی‌هایی مانند BSA است.
مهار واکنش‌های PCR را می‌توان با استفاده از کنترل کیفیت فرآیند داخلی (IPC) نشان داد.
باید دقت شود که تمام معرف‌ها و سایر محلول‌های موجود در کیت استخراج، مانند اتانول، EDTA، CETAB، LiCl، GuSCN، SDS، ایزوپروپانول و فنل، با یک مرحله شستشوی کامل از ایزوله اسید نوکلئیک جدا شوند. بسته به غلظت آنها، ممکن است PCR را فعال یا مهار کنند.