عوامل تداخل در واکنش های PCR

در طی واکنش PCR، اغلب برخی از عوامل تداخلی با آن مواجه می شوند.
با توجه به حساسیت بسیار بالای PCR، آلودگی به عنوان یکی از مهم ترین عوامل موثر بر نتایج PCR در نظر گرفته می شود و می تواند نتایج مثبت کاذب ایجاد کند.
منابع مختلفی که منجر به نتایج منفی کاذب می شوند نیز به همان اندازه مهم هستند. اگر یک یا چند بخش ضروری از مخلوط PCR یا خود واکنش تقویتی مهار یا تداخل داشته باشد، آزمایش تشخیصی می تواند مانع شود. این می تواند منجر به کاهش کارایی و حتی نتایج منفی کاذب شود.
علاوه بر مهار، از دست دادن یکپارچگی اسید نوکلئیک هدف ممکن است به دلیل شرایط حمل و / یا ذخیره سازی قبل از آماده سازی نمونه رخ دهد. به ویژه، دمای بالا یا ذخیره سازی ناکافی ممکن است منجر به آسیب سلول ها و اسیدهای نوکلئیک شود. تثبیت سلول و بافت و جاسازی پارافین از علل شناخته شده تکه تکه شدن DNA و یک مشکل پایدار هستند (شکل 1 و 2 را ببینید). در این موارد، حتی جداسازی و تصفیه بهینه نیز کمکی نخواهد کرد.

شکل 1 | تأثیر بیحرکتی بر یکپارچگی DNA
الکتروفورز ژل آگارز نشان داد که کیفیت DNA جدا شده از بخش های پارافین کالبد شکافی به طور قابل توجهی متفاوت است. بسته به روش تثبیت، DNA با طول‌های متوسط ​​قطعات مختلف در عصاره‌ها وجود داشت. DNA تنها زمانی حفظ شد که در نمونه های منجمد بومی و در فرمالین خنثی بافر ثابت شود. استفاده از یک فیکساتور بوئین قوی اسیدی یا فرمالین بدون بافر حاوی اسید فرمیک منجر به از دست دادن قابل توجه DNA شد. کسر باقی مانده به شدت تکه تکه شده است.
در سمت چپ، طول قطعات در جفت کیلوباز (kbp) بیان می شود.

شکل 2 | از دست دادن یکپارچگی اهداف اسید نوکلئیک
(الف) شکاف 3'-5' روی هر دو رشته منجر به شکست در DNA هدف می شود. سنتز DNA همچنان روی قطعه کوچک اتفاق می افتد. با این حال، اگر محل بازپخت پرایمر روی قطعه DNA وجود نداشته باشد، تنها تقویت خطی رخ می دهد. در مطلوب ترین حالت، قطعات ممکن است یکدیگر را مجدداً اشباع کنند، اما بازده کوچک و کمتر از سطح تشخیص خواهد بود.
(ب) از دست دادن بازها، عمدتاً به دلیل دپوریناسیون و تشکیل دایمر تیمیدین، منجر به کاهش تعداد پیوندهای H و کاهش Tm می شود. در طول فاز گرم شدن طولانی، پرایمرها از DNA ماتریکس ذوب می شوند و حتی در شرایط سخت تر بازپخت نمی شوند.
(ج) بازهای تیمین مجاور یک دایمر TT را تشکیل می دهند.
یکی دیگر از مشکلات رایج که اغلب در تشخیص مولکولی رخ می دهد، آزادسازی کمتر از حد مطلوب اسیدهای نوکلئیک هدف در مقایسه با استخراج فنل-کلروفرم است. در موارد شدید، این می تواند با منفی کاذب همراه باشد. زمان زیادی را می توان با جوشاندن لیز یا هضم آنزیمی بقایای سلولی صرفه جویی کرد، اما این روش اغلب منجر به حساسیت کم PCR به دلیل انتشار ناکافی اسید نوکلئیک می شود.

مهار فعالیت پلیمراز در طول تقویت

به طور کلی، مهار به عنوان یک مفهوم ظرف برای توصیف تمام عواملی که منجر به نتایج PCR غیربهینه می‌شوند، استفاده می‌شود. در یک مفهوم کاملاً بیوشیمیایی، مهار به فعالیت آنزیم محدود می شود، به عنوان مثال، از طریق برهمکنش با محل فعال DNA پلیمراز یا کوفاکتور آن (مثلا Mg2+ برای Taq DNA پلیمراز) از تبدیل سوبسترا به محصول جلوگیری می کند.
اجزای موجود در نمونه یا بافرها و عصاره‌های مختلف حاوی معرف‌ها می‌توانند مستقیماً آنزیم را مهار کرده یا کوفاکتورهای آن (به عنوان مثال EDTA) را به دام بیاندازند، در نتیجه پلیمراز را غیرفعال کرده و به نوبه خود منجر به کاهش یا منفی کاذب نتایج PCR می‌شوند.
با این حال، بسیاری از فعل و انفعالات بین اجزای واکنش و اسیدهای نوکلئیک حاوی هدف نیز به عنوان "مهار کننده PCR" تعیین می شوند. هنگامی که یکپارچگی سلول توسط جداسازی مختل می شود و اسید نوکلئیک آزاد می شود، برهمکنش بین نمونه و محلول اطراف آن و فاز جامد می تواند رخ دهد. به عنوان مثال، 'scavengers' می تواند DNA تک یا دو رشته ای را از طریق برهمکنش های غیر کووالانسی متصل کند و با کاهش تعداد اهدافی که در نهایت به ظرف واکنش PCR می رسد، در جداسازی و خالص سازی تداخل ایجاد کند.
به طور کلی، مهارکننده‌های PCR در اکثر مایعات بدن و معرف‌های مورد استفاده برای آزمایش‌های تشخیصی بالینی (اوره در ادرار، هموگلوبین و هپارین در خون)، مکمل‌های غذایی (اجزای آلی، گلیکوژن، چربی، یون‌های Ca2+) و اجزای موجود در محیط (فنل‌ها) وجود دارند. ، فلزات سنگین)

مهارکننده‌های رایج‌تر PCR را می‌توان در باکتری‌ها و سلول‌های یوکاریوتی، DNA غیرهدف، ماکرومولکول‌های متصل‌کننده به DNA ماتریس‌های بافتی و تجهیزات آزمایشگاهی مانند دستکش‌ها و پلاستیک‌ها یافت. خالص سازی اسیدهای نوکلئیک در حین یا پس از استخراج روش ارجح برای حذف مهارکننده های PCR است.
امروزه، تجهیزات استخراج خودکار مختلف می‌توانند جایگزین بسیاری از پروتکل‌های دستی شوند، اما بازیابی 100% و/یا خالص‌سازی اهداف هرگز محقق نشده است. بازدارنده‌های بالقوه ممکن است هنوز در اسیدهای نوکلئیک خالص وجود داشته باشند یا قبلاً تأثیر گذاشته باشند. استراتژی‌های مختلفی برای کاهش تأثیر مهارکننده‌ها وجود دارد. انتخاب پلیمراز مناسب می تواند تاثیر قابل توجهی بر فعالیت بازدارنده داشته باشد. سایر روش های اثبات شده برای کاهش مهار PCR افزایش غلظت پلیمراز یا استفاده از افزودنی هایی مانند BSA است.
مهار واکنش های PCR را می توان با استفاده از کنترل کیفیت فرآیند داخلی (IPC) نشان داد.
باید دقت شود که تمام معرف ها و سایر محلول های موجود در کیت استخراج مانند اتانول، EDTA، CETAB، LiCl، GuSCN، SDS، ایزوپروپانول و فنل از ایزوله اسید نوکلئیک با یک مرحله شستشوی کامل حذف شوند. بسته به غلظت آنها، ممکن است PCR را فعال یا مهار کنند.