عوامل تداخل در واکنش PCR

در طی واکنش PCR ، برخی از عوامل دخالت اغلب با آن روبرو می شوند.
با توجه به حساسیت بسیار زیاد PCR ، آلودگی یکی از مهمترین عوامل مؤثر بر نتایج PCR در نظر گرفته می شود و می تواند نتایج مثبت کاذب ایجاد کند.
منابع مختلفی که منجر به نتایج منفی کاذب می شوند ، به همان اندازه بسیار مهم هستند. اگر یک یا چند قسمت اساسی از مخلوط PCR یا واکنش تقویت کننده خود مهار یا تداخل شود ، می توان روش تشخیصی را مانع کرد. این می تواند منجر به کاهش کارایی و حتی نتایج منفی کاذب شود.
علاوه بر مهار ، از دست دادن یکپارچگی اسید نوکلئیک هدف ممکن است به دلیل حمل و نقل و/یا شرایط ذخیره قبل از تهیه نمونه رخ دهد. به طور خاص ، درجه حرارت بالا یا ذخیره ناکافی ممکن است منجر به آسیب سلول ها و اسیدهای نوکلئیک شود. تثبیت سلول و بافت و تعبیه پارافین علل شناخته شده ای از تکه تکه شدن DNA و یک مشکل مداوم است (شکل 1 و 2 را ببینید). در این موارد ، حتی جداسازی و تصفیه بهینه نیز کمکی نخواهد کرد.

شکل 1 | تأثیر بیحرکتی بر یکپارچگی DNA
الکتروفورز ژل آگارز نشان داد که کیفیت DNA جدا شده از بخش های پارافین کالبد شکافی به میزان قابل توجهی متفاوت است. DNA با طول قطعه متوسط ​​مختلف بسته به روش تثبیت در عصاره وجود داشت. DNA فقط هنگامی که در نمونه های یخ زده بومی و در فرمالین خنثی بافر ثابت شد ، حفظ شد. استفاده از فرمالین حاوی اسید فرمیک به شدت اسیدی یا بدون فشار ، منجر به از بین رفتن قابل توجه DNA شد. بخش باقیمانده بسیار تکه تکه است.
در سمت چپ ، طول قطعات در جفت کیلوباز (KBP) بیان شده است

شکل 2 | از دست دادن یکپارچگی اهداف اسید نوکلئیک
(الف) شکاف 3 ′-5 در هر دو رشته منجر به استراحت در DNA هدف خواهد شد. سنتز DNA هنوز روی قطعه کوچک رخ خواهد داد. با این حال ، اگر یک سایت بازپرداخت آغازگر در قطعه DNA وجود ندارد ، فقط تقویت خطی رخ می دهد. در مورد مطلوب ترین ، قطعات ممکن است یکدیگر را از بین ببرند ، اما بازده های کوچک و زیر سطح تشخیص خواهد بود.
(ب) از دست دادن پایه ها ، عمدتا به دلیل فروپاشی و تشکیل دیمر تیمیدین ، ​​منجر به کاهش تعداد پیوندهای H و کاهش TM می شود. در مرحله گرم شدن دراز ، آغازگرها از DNA ماتریس ذوب می شوند و حتی در شرایط کمتر سختگیرانه آنیل نمی شوند.
(ج) پایه های تیمین مجاور یک دیمر TT را تشکیل می دهند.
یکی دیگر از مشکلات شایع که اغلب در تشخیص مولکولی رخ می دهد ، انتشار کمتر از بهینه اسیدهای نوکلئیک هدف در مقایسه با استخراج فنل-کلروفرم است. در موارد شدید ، این می تواند با منفی های دروغین همراه باشد. با جوشاندن لیز یا هضم آنزیمی بقایای سلولی می توان زمان زیادی را ذخیره کرد ، اما این روش اغلب به دلیل انتشار کافی اسید نوکلئیک منجر به حساسیت کم PCR می شود.

مهار فعالیت پلیمراز در حین تقویت

به طور کلی ، از مهار به عنوان یک مفهوم کانتینر برای توصیف تمام عواملی که منجر به نتایج PCR زیر حد متوسط ​​می شود ، استفاده می شود. به معنای کاملاً بیوشیمیایی ، مهار محدود به فعالیت آنزیم است ، یعنی ، از طریق تعامل با سایت فعال پلیمراز DNA یا کوفاکتور آن ، از تبدیل محصول بستر جلوگیری می کند یا از آن جلوگیری می کند (به عنوان مثال ، MG2+ برای پلیمراز Taq DNA).
اجزای موجود در نمونه یا بافر و عصاره های مختلف حاوی معرفها می توانند مستقیماً آنزیم را مهار کنند یا کوفاکتورهای آن را به دام بیندازند (به عنوان مثال EDTA) ، در نتیجه غیرفعال کردن پلیمراز و به نوبه خود منجر به کاهش یا کاهش نتایج منفی PCR می شوند.
با این حال ، بسیاری از فعل و انفعالات بین اجزای واکنش و اسیدهای نوکلئیک حاوی هدف نیز به عنوان "مهار کننده های PCR" تعیین شده اند. هنگامی که یکپارچگی سلول با انزوا مختل شود و اسید نوکلئیک آزاد شود ، تعامل بین نمونه و محلول اطراف آن و فاز جامد می تواند رخ دهد. به عنوان مثال ، "Scavengers" می توانند DNA تک یا دو رشته ای را از طریق تعامل غیر کووالانسی متصل کرده و با کاهش تعداد اهداف که در نهایت به رگ واکنش PCR می رسند ، در انزوا و تصفیه تداخل کنند.
به طور کلی ، مهار کننده های PCR در بیشتر مایعات بدن و معرفهای مورد استفاده برای آزمایش های تشخیصی بالینی (اوره در ادرار ، هموگلوبین و هپارین در خون) ، مکمل های غذایی (اجزای ارگانیک ، گلیکوژن ، چربی ، یونهای CA2) و اجزای موجود در محیط (فنل ها ، فلزات سنگین) وجود دارند.

مهار کننده های شیوع PCR بیشتر در باکتری ها و سلولهای یوکاریوتی ، DNA غیر هدف ، ماکرومولکولهای اتصال دهنده DNA از ماتریس های بافتی و تجهیزات آزمایشگاهی مانند دستکش و پلاستیک را می توان یافت. تصفیه اسیدهای نوکلئیک در طی یا بعد از استخراج روش ارجح برای از بین بردن مهار کننده های PCR است.
امروزه ، تجهیزات مختلف استخراج خودکار می توانند بسیاری از پروتکل های دستی را جایگزین کنند ، اما 100 ٪ بازیابی و/یا تصفیه اهداف هرگز حاصل نشده است. مهارکننده های بالقوه ممکن است هنوز در اسیدهای نوکلئیک خالص وجود داشته باشند یا ممکن است قبلاً نیز اثر داشته باشند. استراتژی های مختلفی برای کاهش تأثیر مهار کننده ها وجود دارد. انتخاب پلیمراز مناسب می تواند تأثیر معنی داری در فعالیت مهار کننده داشته باشد. سایر روشهای اثبات شده برای کاهش مهار PCR افزایش غلظت پلیمراز یا استفاده از مواد افزودنی مانند BSA است.
مهار واکنشهای PCR را می توان با استفاده از کنترل کیفیت فرآیند داخلی (IPC) نشان داد.
باید مراقب باشید تا کلیه معرفها و سایر راه حل های موجود در کیت استخراج مانند اتانول ، EDTA ، CETAB ، LICL ، GUSCN ، SDS ، ایزوپروپانول و فنل از اسید نوکلئیک جدا شود. بسته به غلظت آنها ، ممکن است PCR را فعال یا مهار کنند.